Генные «ножницы» CRISPR/Cas9. Величайшая технология XXI века

В 2016 году государственное агентство HFEA (Управление по эмбриологии и искусственному оплодотворению) впервые в мире разрешило проводить генетическую модификацию человеческих эмбрионов при помощи технологии CRISPR/Cas9, а уже в 2024 году с помощью того же инструмента лечат ВИЧ и наиболее агрессивные формы рака, такие как глиобластома и метастазированный рак яичников.

Но что такое CRISPR? Если коротко, то это механизм редактирования генома, который за нас придумала природа. Впервые он был открыт еще в 80-х годах прошлого века, но прошло несколько десятков лет и сменилось поколение ученых, прежде чем те поняли, как применять его на людях. В этой статье мы расскажем всё об этом величайшем открытии, которое способно изменить биологию человека и, возможно, даже даровать ему бессмертие. Что это, как устроено (максимально доступным языком, конечно), как появилось и, конечно же, во что стоит верить и на что надеяться?

Всё началось с солончаков и архебактерий

Итак, в конце 80-х неподалеку от испанского города Аликанте аспирант Франсиско Мохика изучал архебактерии, живущие в соленой воде в солончаках — типе почвы, которая образовывается из солей и препятствует росту большинства видов растений. Так вот, эти архебактерии имели в своем геноме фрагменты длиной 30 нуклеотидов, которые повторялись много-много раз и отделялись друг от друга странными участками ДНК, похожими на блоки. Тогда никто из ученых не понял, для чего служат эти структуры, и был сделан вывод, что они «отвечают за регуляцию» (так биологи объясняют всё, что на самом деле не понимают). Тогда же им было дано название CRISPR, то есть Clustered Regularly Interspaced Palindromic Repeats.

Мохика, однако, исследования в данном направлении не бросил. Он нашел подобные повторы и у других бактерий, а значит, то была уже закономерность, и у нее явно должно было быть какое-то важное предназначение. Какое именно, удалось выяснить только в 2000-х годах, когда GenBank, в который ученые «складируют» все расшифрованные последовательности ДНК, накопил достаточно данных, чтобы с помощью BLAST (сравнительный алгоритм) выделить среди них организмы, в которых CRISPR встречается чаще всего, и наконец-то ответить на вопрос, что же это такое. Оказывается, CRISPR хранит память бактерий о вирусах, которыми те болели. Но как и для чего бактерии используют эту память? Это осталось загадкой, и ученые продолжили выяснять.

Следующий важный шаг в раскрытии тайны CRISPR сделал микробиолог Филипп Хорват во время исследования технологий закваски капусты. Конкретно его интересовали молочные бактерии, поскольку бактериофаги (вирусы, уничтожающие бактерии, в том числе те самые полезные, благодаря которым изготавливается квашеная капуста) были огромной проблемой в молочной промышленности. Они влегкую уничтожали заквасочные культуры, из-за чего компании несли убытки. Хорват же искал способ сделать закваски устойчивыми к ним, и в процессе он наткнулся на CRISPR. Именно Хорват впоследствии выяснил и доказал, что с помощью CRISPR бактерии перенимают часть ДНК вируса и тем самым становятся к нему устойчивы, то есть приобретают иммунитет.

Бактериальная клетка, которая перенесла «сражение» с бактериофагом и не умерла, режет его геном на «спагетти» и встраивает в свою ту самую CRISPR-структуру, а затем передает эти структуры еще и потомкам, которые тем самым от рождения устойчивы к бактериофагам, пережитым их родителем. То есть CRISPR-массивы — это иммунная система бактерий. К слову, мы все с вами ели йогурты и сыр, а значит, ели и эти самые CRISPR-структуры, благодаря которым эти продукты успешно заквасились.

Не будем описывать, как именно кусочки ДНК бактериофагов сохраняются в ДНК бактерий, режутся и преобразуются биологически — это сложно. Главное то, что механизм CRISPR похож на ножницы: нуклеаза Cas9 «садится» на нужный сегмент ДНК бактериофага, вырезает его — чик-чик — и тем самым предотвращает размножение вируса.

CRISPR/Cas9 в генной инженерии: большие перспективы и одна ма-аленькая загвоздка

Вы, наверное, уже интуитивно понимаете, как природная технология бактерий CRISPR/Cas9 применяется в генной инженерии? Впервые идею опробовать эту «систему» для резки ДНК непосредственно человека предложили женщины-ученые Эмманюэль Шарпантье и Дженнифер Даудна, познакомившиеся на конференции в Коста-Рике. Они объединили усилия своих лабораторий и поделились результатами исследований с журналом Science в 2012 году, благодаря чему получили Нобелевскую премию (и, к слову, стали первыми женщинами, получившими данную премию без мужского сопровождения, еще и всего через 8 лет после публикации научной работы). Согласно этим исследованиям, ДНК абсолютно любого живого организма действительно можно редактировать при помощи CRISPR/Cas9, правда, только в пробирке.

На живые клетки с ядрами технологию CRISPR/Cas9 впервые перенес китайско-американский ученый Фэн Чжан из MIT: он смог отредактировать не только геном человека таким образом, но и геном мышей, дрозофил, рыб и дрожжей (словом, всех подопытных лаборатории). 

В чём же, собственно, проблема CRISPR/Cas9 и почему мы до сих пор не отредактировали следующее поколение детей или самих себя? А «загвоздка» вот в чём: ДНК — крайне стабильная структура, возможно, самая стабильная в мире, поскольку возраст самой старой ДНК на сегодняшний день превышает 1,7 млн лет. А значит, что с ней ни делай, хоть жги, она сохраняется. Молекула ДНК мгновенно реагирует на любые разрывы, которые CRISPR/Cas9, эти самые «ножницы», и производит. Как только разрыв появляется, клетка срочно запускает процесс ремонта ДНК, и тут возможно два пути развития: 

• Гомологичная рекомбинация. У всех животных минимум две копии каждой хромосомы, чтобы, если возникнет разрыв, можно было «залатать» его с помощью копии. Но клетку можно обмануть: чтобы она не восстановила обратно поврежденную хромосому, ей подсовывают похожий фрагмент ДНК, но с нужной мутацией (здоровый). Тогда клетка чинит разрыв, встроив то, что нужно ученым, и всё идеально.
• Негомологичная рекомбинация. Поскольку разрыв вызывает разрыв последовательности фрагментов, и клетка не может считывать информацию, которую он несет, ген попросту перестает выполнять свою функцию и ломается вообще. 

Следовательно, нужно вызывать именно гомологичную рекомбинацию, но сделать это не так-то просто. Обычно репарация происходит именно по второму, не самому удачному для ученых и самого живого организма пути. Ведь ген всё-таки нужно не разрушить полностью (это ученые и так давно умеют), а починить. 

Плюс CRISPR-реагентов в том, что они стоят по 10‒20 евро, что в тысячи раз дешевле предыдущих инструментов для редактирования генов и позволяет проводить исследования быстро и в колоссальных масштабах, что сразу подстегнуло развитие биотехнологической промышленности. Теперь главная задача ученых — узнать, как вносить разрыв в ДНК, не вызывая при этом повреждений. Однако само понимание принципов работы CRISPR и их перспектив — уже прорыв.

Помидоры, поросята и костный мозг: где можно применить генное редактирование

Вы знали, что людям нередко пересаживают органы свиней благодаря их биологической совместимости? Поскольку человеческих органов на всех нуждающихся, само собой, не хватает. Однако в геноме свиней содержится много спящих ретровирусов, которые в любой момент могут активизироваться в человеке и представлять смертельную опасность. Так, редактирование генома уже позволило вывести «чистую» породу свиней с инактивированными вирусами, чьи органы не будут угрожать здоровью пациента. 

А еще с помощью CRISPR отредактировали количество веток на томатном кусте и размер плодов, благодаря чему удалось сделать так, что теперь из одного черенка прорастает сразу пять ветвей, которые дают в три раза больше плодов. Синяя клубника, черные помидоры, мини (очень мини, размером с персик) арбузы — всё это тоже редактирование генов, как и коровы с серыми пятнами вместо черных, что делает их более устойчивыми к жаре в жарком климате. 

Долгое время генно-модифицированные продукты были запрещены к повсеместному выращиванию в Европе из-за невозможности предсказать долгосрочные последствия их влияния на остальной мир (вдруг генно-модифицированная капуста однажды приведет к гибели шелковичных червей?). То, как такие продукты влияют на человеческое здоровье (и влияют ли вообще), предсказать было невозможно тоже, но вот изменения, вносимые с помощью CRISPR, абсолютно безопасны по той причине, что он вносит мутации без всяких следов. То есть CRISPR заменяет селекцию, позволяя выводить, например, устойчивые к любому климату растения.

В случае же с человеком CRISPR наиболее перспективен сегодня в области лечения генетических заболеваний, например, сахарного диабета, шизофрении или серповидноклеточной анемии — всего того, предрасположенность к чему передается человеку из-за сломанных при рождении генов. Здесь, правда, возникает проблема масштабирования: чтобы починить, например, мутацию, вызывающую диабет, нужно чинить всю поджелудочную железу. А клетки, как мы уже говорили, всегда защищаются от вторжения в их ДНК. Поэтому пока самое простое для ученых — начать с костного мозга и крови, то есть того, что можно изменить и размножить в пробирке, а затем перелить или пересадить человеку обратно и «заразить» сломанную ДНК здоровой. Так, нередко у ВИЧ-инфицированных развивается лейкоз. В ходе одного эксперимента такому больному пересадили костный мозг донора, убрав мутацию гена CCR5, благодаря чему пациент излечился и от лейкоза, и от ВИЧ. 

Интересная история

В 2018 году в Китае ученый Хэ Цзянькуй провел несанкционированный эксперимент над человеческими эмбрионами, получив эмбрионы от пар, в которых отцы были инфицированы ВИЧ. С помощью CRISPR он починил ген CCR5, и у пар в сумме родилось трое здоровых детей. Целью Хэ Цзянькуя было создать у эмбрионов с помощью CRISPR полноценный врожденный иммунитет к ВИЧ (такой действительно существует примерно у 3–4% населения Земли, по разным данным), но не получилось. В итоге эксперимент был признан бессмысленным (поскольку у ВИЧ-инфицированных пар при правильной терапии и так рождаются здоровые дети), а самого ученого обвинили в нарушении общечеловеческой этики, оштрафовали и посадили на 3 года в тюрьму. И тем не менее его эксперимент наглядно показал, как у больных может родиться здоровое потомство благодаря технологии CRISPR. 

Способность менять геном и ДНК по сей день своего рода святой Грааль для всех биотехнологов, медиков и ученых. CRISPR/Cas9 на текущий момент ближе всего к тому, чтобы вложить этот Грааль прямо им в руки. В перспективе CRISPR/Cas9 может чинить не только полностью сломанные гены, и те гены, которые лишь повышают риск для здоровья в будущем или «не нравятся» человеку, как цвет волос или глаз, или даже увеличивать мышечную массу и таким образом способствовать успехам в спорте и т.д. Всё это, конечно, напоминает фантастическую утопию в духе «О дивного нового мира», но пока еще рано говорить о том, что утопия действительно грядет. Повреждения вследствие разрыва, сложность с «доставкой» CRISPR/Cas9 во все нужные клетки и органы, а также долгосрочные последствия, которые могут проявиться у человека лишь спустя десятилетия, — всё это ученым только предстоит изучить. Но мы верим, что рано или поздно и их, и наши грезы перестанут быть научной фантастикой и станут повседневной реальностью!